ELISA試劑盒實驗在必定溫度下的反響時刻并不是反響的結尾，溫育時刻過短、溫度過低，易致顯色不全；溫育時刻過長、溫度過高，易致非特異性緊附于反響孔周圍，難以清潔*，發生陰性高值或假陽性反響。
要嚴厲按規則的溫度和溫育時刻進行。如果參加的酶物過多或加在較高的孔壁上或孔口，也會致使本底添加或假陽性。
水浴箱門，嚴厲控制水浴的溫度為37±0.5。同時，微孔板不可堆疊放置，以確保傳熱均勻，各板的溫度都能敏捷到達平衡。
當標本收集保留不妥發生溶血時，紅細胞中的血紅蛋白釋放到血清中，血紅蛋白具有過氧化物酶的性質，其通過吸附或“PP效應"（蛋白質間相互吸附的景象）后，可催化A、B液顯色而形成假陽性。
因為試劑盒一般設定的反響溫度為37度，在這個溫度下溫育必定時刻，蒸騰的水分會許多，關于全部反響系統來講，各種反響物的濃度會不斷地添加，這么必會致使反響zui終的值添加。
如果ELISA試劑盒樣品稀釋液少加或血清多加，都會致使本底增高。關于間接法來說，受上述兩個因素影響更大。
因為血清中受檢的特異性IgG只，IgG中的一小有些。IgG的吸附性很強，非特異性IgG可直接吸附到固相載體上，有時也可吸附到包被抗原的外表。
這些非特異性的IgG均能夠和酶標二抗發作反響而形成較高陰性本底或假陽性。假如參加的血清過多，高于規則的稀釋倍數，很容易形成高值陰性。反之，形成假陰性。